Primjena RT-PCR-a u stvarnom vremenu u Covid-19

Šta je RT - PCR u stvarnom vremenu?

Dodavanje fluorescentnih gena u PCR reakcijski sustav, korištenjem akumulacije fluorescentnog signala za nadziranje cjelokupnog procesa PCR-a u stvarnom vremenu, a zatim kvantifikacija nepoznatog obrasca pomoću standardne krivulje naziva se realnom vremenu fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija, poznata i kao Q u stvarnom vremenu. -PCR.

Princip PCR amplifikacije isti je kao i kod običnog PCR instrumenta, osim što su primeri dodani tijekom PCR amplifikacije označeni izotopima, fluoresceinom itd., A prajmeri i fluorescentne sonde se koriste za specifično vezanje na predložak za pojačavanje kod isto vrijeme.

Pojačani rezultati se prikupljaju i prenose u sistem računalne analize i obrade putem signala za prikupljanje u realnom vremenu sustava za prikupljanje fluorescentnih signala kako bi se dobio kvantitativni izlaz u stvarnom vremenu.

RT-PCR u stvarnom vremenu jedna je od najčešće korištenih laboratorijskih metoda za otkrivanje COVID-19 virusa. Iako su mnoge zemlje koristile RT-PCR u stvarnom vremenu za dijagnosticiranje drugih bolesti, kao što su virus ebole i Zika virus, mnogima je potrebna podrška u prilagođavanju ove metode za virus COVID-19, kao i za povećanje nacionalnog kapaciteta za testiranje.

Kako RT-PCR u stvarnom vremenu djeluje s virusom COVID-19?

Uzorak se uzima iz dijelova tijela na kojima se okuplja virus COVID-19, kao što su nos ili grlo osobe. Uzorak se tretira s nekoliko kemijskih otopina koje uklanjaju tvari poput bjelančevina i masti i iz njih se izdvaja samo RNA prisutna u uzorku. Ova ekstrahirana RNA predstavlja mješavinu vlastitog genetskog materijala i, ako postoji, RNA virusa.

RNA se reverzno transkribira u DNK pomoću specifičnog enzima. Naučnici zatim dodaju dodatne kratke fragmente DNK koji su komplementarni određenim dijelovima prepisane virusne DNK. Ako je virus prisutan u uzorku, ti se fragmenti pričvršćuju na ciljane dijelove virusne DNK. Neki dodani genetski fragmenti koriste se za izgradnju DNA lanaca tokom amplifikacije, dok se drugi koriste za izgradnju DNK i dodavanje oznaka markera u lancima, koji se potom koriste za otkrivanje virusa.

Zatim se smeša stavi u RT-PCR mašinu. Mašina prolazi kroz temperature koje zagrijavaju i hlade smjesu kako bi pokrenule specifične kemijske reakcije koje stvaraju nove, identične kopije ciljnih odjeljaka virusne DNK. Ciklus se ponavlja iznova i iznova kako bi se nastavilo kopiranje ciljnih odjeljaka virusne DNK. Svaki ciklus udvostručuje prethodni broj: dvije kopije postaju četiri, četiri kopije postaju osam i tako dalje. Standardno RT-PCR postavljanje u stvarnom vremenu obično prolazi kroz 35 ciklusa, što znači da se do kraja procesa stvori oko 35 milijardi novih kopija odseka virusne DNK iz svakog lanca virusa prisutnog u uzorku .

Kako se grade nove kopije virusnih odseka DNK, oznake markera pričvršćuju se na pramenove DNK, a zatim oslobađaju fluorescentnu boju koja se meri računarom mašine i prikazuje u stvarnom vremenu na ekranu. Računalo prati količinu fluorescencije u uzorku nakon svakog ciklusa. Kada se premaši određeni nivo fluorescencije, to potvrđuje da je virus prisutan. Naučnici takođe prate koliko je ciklusa potrebno da bi se dostigla ova razina da bi procijenili težinu infekcije: što je manje ciklusa, to je virusna infekcija teža.

Zašto koristiti RT-PCR u stvarnom vremenu?

RT-PCR tehnika u stvarnom vremenu vrlo je osjetljiva i specifična i može dati pouzdanu dijagnozu za samo tri sata, mada laboratoriji u prosjeku traju između šest i osam sati. U usporedbi s drugim dostupnim metodama izolacije virusa, RT-PCR u stvarnom vremenu je znatno brži i ima niži potencijal za kontaminaciju ili pogreške, jer se cijeli proces može izvesti u zatvorenoj epruveti. I dalje je najpreciznija metoda za otkrivanje virusa COVID-19.

Međutim, RT-PCR u stvarnom vremenu ne može se koristiti za otkrivanje prošlih infekcija, što je važno za razumevanje razvoja i širenja virusa, jer virusi u organizmu postoje samo tokom određenog vremenskog perioda. Neke su metode potrebne za otkrivanje, praćenje i proučavanje prošlih infekcija, posebno onih koje su se mogle razviti i proširiti bez simptoma.